RMN

La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est une technique de spectroscopie pouvant être utilisée dans le but d'obtenir des propriétés structurelles et dynamiques pour des molécules en exploitant le comportement de certains atomes lorsqu'ils sont placés dans des aimants super-conducteurs très puissants (180 000 à 360 000 fois plus puissants que le champ magnétique terrestre pour les aimants d’UConn Health). Lorsque les noyaux actifs RMN sont placés dans un puissant champ magnétique, leurs noyaux s'alignent avec le champ et commencent à fonctionner à une fréquence qui dépend du rapport gyromagnétique des isotopes et de la puissance du champ magnétique appliqué, en même temps que de l’environnement chimique et physique de l’atome. La composante de la fréquence qui dépend de l’environnement chimique et physique est appelée le décalage chimique. Les expérience RMN perturbent l’alignement car elles appliquent de brèves pulsations à l'énergie de la fréquence radio (RF) afin de déterminer le décalage chimique de chaque atome RMN actif dans la molécule étudiée. En recourant à des combinaisons de pulsations et de délais (connues comme une séquence de pulsations), on peut confirmer des informations supplémentaires, telles que le type d'atomes liés les uns aux autres, et le type d'atomes situés à proximité les uns des autres. En réalisant de nombreuses expériences différentes, il est possible de déterminer la structure tridimensionnelle des molécules, y compris les grosses biomolécules telles que les protéines.

Des examens RMN haute-résolution sont davantage faisables pour les protéines dont la masse est inférieure à approximativement 25 kDa et qui sont solubles à hauteur d’environ 0,5 mM. Dans certains cas, il peut être possible d’examiner des protéines ou des complexes de taille supérieure ou ayant un degré de solubilité plus faible. Les protéines membranaires sont difficiles à étudier à l'aide de méthodes haute-résolution, mais de nouvelles techniques qui apparaissent peuvent être applicables ici. Étant donné que les examens RMN nécessitent un étiquetage, la protéine ayant des isotopes stables 15N, 13C, et parfois 2H (un système d’expression compatible avec la croissance dans des milieux étiquetés) doit être disponible. Il faut purifier les protéines (habituellement à hauteur de >95 %), les replier, et il faut qu’elles soient stables, du moins marginalement. Une caractérisation préliminaire via un dichroïsme circulaire et une dénaturation par la chaleur ou par des solvants est recommandée.

Il est difficile de répondre à cette question, car cela dépend de ce qui est recherché et du comportement de l’échantillon. Habituellement, on a besoin de 300 µl (avec des tubes RMN spéciaux) à 600 µl d'échantillon. Les concentrations en protéines pour les systèmes qui se comportent bien doivent être supérieures à 150 µM pour les examens structurels, mais on peut également utiliser des concentrations plus faibles pour d’autres examens, non structurels. Alors que la valeur de 150 µM constitue une estimation grossière de la concentration la plus faible à utiliser pour les examens structurels, il est conseillé de rendre les concentrations en protéines les plus élevées possibles, car elles doivent être limitées par la solubilité et le comportement des protéines, mais pas par la quantité de protéines préparées. Le temps nécessaire à la réalisation d’expériences plus longues afin de compenser de faibles concentrations, et le temps accru que prend l’interprétation des spectres RMN, seront certainement plus longs que la durée de préparation d'un échantillon supplémentaire.

Une fois que l’échantillon a été suffisamment purifié et séché, l’étape suivante consiste à choisir le solvant approprié. Étant donné que le deutérium est, et de loin, le noyau de blocage le plus populaire, l'échantillon est habituellement dissout dans un solvant deutéré (un solvant deutéré est un solvant dans lequel une grande proportion d'atomes d’hydrogène, généralement plus de 99 %, ont été remplacés par du deutérium). Les solvants deutérés habituellement utilisés sont l’acétone-d6, le benzène-d6 et le chloroforme-d, même si bien d'autres solvants sont disponibles.

Les facteurs déterminant ce choix sont :

1. La solubilité :

• Il est clair que plus l'échantillon est soluble, mieux c’est. En effet, cela maximise la quantité d'échantillon dans le volume sensible, ce qui augmente la sensibilité de l’expérience. Une solubilité élevée est particulièrement importante si seules de petites quantités d'échantillon sont disponibles.

2. L’interférence entre les signaux des solvants et le spectre de l’échantillon

• Le solvant lui-même produira inévitablement des signaux RMN qui obscurciront des régions du spectre. Ces « pics résiduels de solvant » ne doivent pas se chevaucher avec des signaux émanant de l’échantillon.

3. La dépendance à la température :

• Pour les expériences effectuées à une température supérieure ou inférieure à la température ambiante, les points de mélange et d'ébullition des solvants constituent également des facteurs importants. En outre, la solubilité de l’échantillon a tendance à varier en fonction de la température.

4. La viscosité :

• Plus la viscosité du solvant est faible, meilleure est la résolution de l’expérience.

5. Les coûts :

• Il est clair que pour les RMN de routine, où il faut mesures de nombreux échantillons, le coût des solvants constitue un aspect important. L'une des règles de base, c’est que le prix augmente avec le nombre d'atomes deutérés.

6. La teneur en eau :

• Presque tous les solvants RMN contiennent des traces d’eau. Ainsi, bon nombre d’entre eux sont hygroscopiques (ils absorbent l’eau de l’atmosphère) et, par conséquent, plus ils sont stockés longtemps, plus ils contiennent de l’eau. La présence d’un pic d’eau (HDO) ne servira qu’à dégrader la qualité su spectre RMN. On peut réduire considérablement la teneur en eau de solvants en filtrant ces derniers par un agent de séchage ou en les stockant sur des tamis moléculaires.
• Le choix du solvant adapté à un échantillon donné établira le meilleur compromis entre les avantages et les inconvénients de chacun d’entre eux. Pour obtenir des informations détaillées sur un solvant donné, veuillez consulter le texte RMN standard.