Solutions de cytométrie

La cytométrie en flux est une technologie basée sur le laser utilisée pour la détection et la mesure des caractéristiques physiques et chimiques des cellules ou des particules lorsqu'elles circulent dans une suspension fluide à travers un trajet lumineux. 

La cytométrie en flux est une technique puissante qui est largement utilisée pour identifier et caractériser différentes cellules immunitaires dans des échantillons hétérogènes. Elle repose principalement sur l'utilisation de molécules marquées par fluorescence pour identifier et caractériser les profils antigéniques dans diverses applications de recherche et pour le diagnostic clinique sur une base unicellulaire.

En utilisant différents fluorochromes dont les longueurs d'onde d'émission couvrent l'ensemble du spectre des couleurs, les protéines associées aux compartiments de surface, cytosolique et nucléaire peuvent être détectées simultanément.

La cytométrie en flux est une technique incroyablement polyvalente et de nombreuses variantes de cette technique ont été développées ces dernières années. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est un dérivé de la cytométrie en flux ajoutant un degré supplémentaire de fonctionnalité. Dans la pratique, les termes « cytométrie en flux » et « FACS » sont souvent utilisés de manière interchangeable.

La cytométrie en flux s'est révélée être un outil d'analyse précieux dans le domaine du diagnostic de maladies. Un grand nombre de cellules peuvent être analysées en quelques minutes, ce qui confère des avantages pour l'étude par rapport à d'autres méthodes d'analyse telles que la « cellometer vision » ou la microscopie.

Applications de cytométrie pour l'analyse

Dans un cytomètre à flux :

• Les cellules de l'échantillon passent une par une dans un canal étroit.
• La lumière est utilisée pour éclairer les cellules dans le canal.
• Une série de capteurs détectent les types de lumière qui sont réfractées ou émises par les cellules.
• Les données acquises par les capteurs sont compilées et intégrées afin de construire une image complète de l'échantillon.

La cytométrie en flux utilise des marqueurs fluorescents pour identifier et analyser les composants cellulaires. L'ADN, l'ARN, les protéines ou d'autres molécules de la cellule sont marqués avec des colorants fluorescents. Si des impulsions laser sont ensuite « tirées » sur la cellule, les molécules marquées sont brièvement illuminées. 

La lumière émise dans chaque cellule peut alors être détectée par le cytomètre en flux et la quantité relative de chaque composant peut être mesurée grâce à son intensité. Il s'agit d'une procédure cruciale pour le diagnostic et le pronostic de maladies.

L'analyse des données de la cytométrie en flux repose sur le principe du « cloisonnement ». Des portes et des régions sont placées autour de populations de cellules présentant des caractéristiques communes, généralement la diffusion vers l'avant, la diffusion latérale et l'expression des marqueurs, afin d'étudier et de quantifier les populations d'intérêt. 

La sélection permet au chercheur de recueillir et d'afficher plus d'informations sur une sous-population de cellules qu'il ne pourrait normalement le faire sur un graphique en points à deux ou trois dimensions.

Un cytomètre en flux est composé de trois systèmes principaux : la fluidique, l'optique et l'électronique. 

• Le système fluidique transporte les particules dans un flux vers le faisceau laser pour l'interrogation.
• Le système optique se compose de lasers destinés à éclairer les particules dans le flux d'échantillons, et de filtres optiques destinés à diriger les signaux lumineux résultants vers les détecteurs appropriés.
• Le système électronique convertit les signaux lumineux détectés en signaux électroniques qui peuvent être traités par l'ordinateur. Pour certains instruments équipés d'une fonction de tri, le système électronique est également capable de déclencher des décisions de tri afin de charger et de dévier les particules.

Une machine de cytométrie en flux est utilisée pour effectuer des tâches importantes pour le diagnostic des maladies :

• Numération des cellules sanguines
• Observation de différents types de leucocytes dans un échantillon
• Tri de cellules T afin de déterminer comment leur fonction a été affectée par une infection
• Détermination du contenu total d'ADN dans les cellules lors de biopsies de tumeurs dans la recherche sur le cancer
• Étude de l'effet des maladies infectieuses sur des cellules individuelles grâce au tri cellulaire
• Détection de microbes pathogènes dans les échantillons biologiques et environnementaux
• Détection de cellules minimes résiduels d’une maladie dans les fluides corporels

Bien que la cytométrie en flux soit bien établie en tant que technique de biologie cellulaire, le développement de la cytométrie en flux à haut débit (HTFC), rendu possible par l'introduction d'un échantillonnage plus rapide sur plaque, a transformé cette technologie en une plateforme attrayante de découverte de médicaments.

Voici quelques-unes des principales applications de la cytométrie en flux (dans le cadre d'un environnement clinique moderne) : 

• Expression des protéines dans l'ensemble de la cellule, même le noyau
• Modifications post-traductionnelles des protéines - y compris les protéines clivées et phosphorylées
• ARN - y compris les miARN et les transcriptions d'ARNm
• État de santé des cellules - détection des cellules apoptotiques ou de la mort de cellules
• État du cycle cellulaire : outil puissant permettant d’évaluer les cellules en phase G0/G1 par rapport à la phase S, G2 ou polyploïdie, y compris l'analyse de la prolifération et de l'activation de cellules
• Identification et caractérisation de sous-ensembles distincts de cellules dans un échantillon hétérogène, notamment en distinguant les cellules mémoires effectrices centrales des cellules T épuisées ou des cellules T régulatrices

Sélection de cellules

Par rapport à d'autres techniques d'isolement comme la séparation par billes magnétiques et le panning, la cytométrie en flux offre les avantages suivants :

• Plus grande pureté 
• Peut séparer les types de cellules en fonction de leur niveau d'intensité de fluorescence
• Meilleure séparation des populations à l'aide d'anticorps multiples
• Récupération accrue des cellules d'intérêt
• Peut éliminer les cellules mortes
• Peut trier en fonction de la coloration interne (ADN, expression de cytokines, GFP, etc.).
• Peut trier jusqu'à quatre populations simultanément

Inconvénients ou limites de la cytométrie en flux :

• Le laser ne peut analyser qu'une seule cellule à la fois 
• Les cellules doivent être en suspension pour être analysées (ce qui limite l'analyse des tissus) 
• Des opérateurs hautement qualifiés sont nécessaires
• Les cellules doivent être viables pour être analysées

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La cytométrie en flux est passée du statut de nouvelle technologie prometteuse à celui d'outil de diagnostic scientifique indispensable. Et les frontières des applications de la cytométrie en flux ne cessent de s'élargir. 

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